begränsning kartläggning dubbla smälta problem

1. Varför finns det dubbla matsmältningsbegränsningar?
2. Varför fungerar min begränsning inte??
3. Vad händer om du lägger till för mycket restriktionsenzym?
4. Kan två restriktionsenzymer klippas på samma plats?
5. Hur beräknar du restriktionssmältning??
6. Hur lång tid ska en begränsning smälta ta?
7. Är värmeinaktivering av restriktionsenzymer nödvändig?
8. Går restriktionsenzymer ut?
9. Hur kan restriktionssmältning förhindras?
10. Varför skulle ett restriktionsenzym inte klippa?
11. Hur väljer du restriktionsenzymer?
12. Varför behöver restriktionsenzymer förvaras på is?

Varför finns det dubbla matsmältningsbegränsningar?

Att smälta ett DNA-substrat med två restriktionsendonukleaser samtidigt (dubbel matsmältning) är ett vanligt tidsbesparande förfarande. Att välja den bästa NEBuffern för att tillhandahålla reaktionsförhållanden som optimerar enzymaktivitet samt undviker stjärnaktivitet associerad med vissa enzymer är en viktig faktor..

Varför fungerar min begränsning inte??

Ofullständig eller ingen matsmältning på grund av enzymaktivitet blockerad av DNA-metylering. Om ditt enzym är aktivt och smälter kontroll-DNA och reaktionen är inställd med optimala förhållanden, men du fortfarande ser problem med matsmältningen, kan det bero på att enzymet hämmas av metylering av mall-DNA.

Vad händer om du lägger till för mycket restriktionsenzym?

Ofullständig matsmältning kan inträffa när för mycket eller för lite enzym används. Närvaron av föroreningar i DNA-provet kan hämma enzymerna, vilket också resulterar i ofullständig matsmältning.

Kan två restriktionsenzymer klippas på samma plats?

Du kan göra med rätt kontroller som enstaka restriktionsmältning och båda enzymerna tillsammans för att se till att båda skär oberoende och tillsammans också och gå vidare med dina planer. Tyvärr var jag begränsad till dessa två enzymer som råkar ha platser bredvid varandra!

Hur beräknar man restriktionssmältning?

Beräkna mängden av var och en som du behöver lägga till en restriktionsdigerering för att smälta 5ug (5000ng) DNA med 5 enheter enzym. Till exempel om mitt DNA har 190 ng / ul, skulle jag behöva: 5000 ng / 190 ng / ul = 26 ul av mitt prov.

Hur lång tid ska en begränsning smälta ta?

* Pro-tip * Beroende på applikation och mängden DNA i reaktionen kan inkubationstiden variera från 45 minuter till över natten. För diagnostiska smältningar är 1-2 timmar ofta tillräckliga. För smältning med >1 µg DNA som används för kloning rekommenderas att du smälter i minst 4 timmar.

Är värmeinaktivering av restriktionsenzymer nödvändig?

FAQ: Är det nödvändigt att inaktivera restriktionsenzymer efter vektorsmältningen? Inaktivering av restriktionsendonukleaser är vanligtvis inte nödvändig, men i vissa fall kan det öka transformationseffektiviteten.

Går restriktionsenzymer ut?

Alla enzymer analyseras för aktivitet var 3-6 månader; utgångsdatumet anges på etiketten som sitter på varje injektionsflaska med enzym. Efter trettiofem års erfarenhet av restriktionsenzymer har vi funnit att de flesta är mycket stabila när de lagras vid -20 ° C i den rekommenderade lagringsbufferten.

Hur kan begränsning smälta förhindras?

Protokoll för restriktionsenzymsmältning

1. Lägg till komponenter i ett rent rör i den ordning som visas: ...
2. Inkubera reaktionen vid matsmältningstemperaturen (vanligtvis 37 ° C) i 1 timme.
3. Stoppa matsmältningen genom värmeinaktivering (65 ° C i 15 minuter) eller tillsats av 10 mM slutkoncentration EDTA.
4. Det smälta DNA är klart för användning i forskningsapplikationer.

Varför skulle ett restriktionsenzym inte skäras?

FAQ: Varför skär inte mitt restriktionsenzym DNA? ... Om kontroll-DNA klyvs och experimentellt DNA motstår klyvning kan de två DNA: n blandas för att avgöra om det finns en hämmare i experimentprovet. Om en hämmare (ofta salt, EDTA eller fenol) är närvarande kommer kontroll-DNA inte att klippa efter blandning.

Hur väljer du restriktionsenzymer?

När du väljer restriktionsenzymer vill du välja enzymer som:

1. Flankera din insats, men skär inte i insatsen.
2. Är på önskad plats i din mottagarplasmid (vanligtvis i Multiple Cloning Site (MCS)), men skär inte någon annanstans på plasmiden.

Varför behöver restriktionsenzymer förvaras på is?

Behöver enzymer verkligen hållas på is hela tiden? ... Enzymer måste lagras och användas vid optimala temperaturer. Enzymer lagras vanligtvis i glycerol vid -20 ° C. Detta hindrar dem från att frysa helt, vilket orsakar proteindenaturering och resulterar i förlust av aktivitet.