western blot teknik, teori och felsökning

1. Vad är principen för Western blotting?
2. Hur fungerar Western blot-testet?
3. Varför smetas min Western-fläck?
4. Vad visar Western blot-analys?
5. Vilken funktion har Western blot??
6. Vilka är tillämpningarna av Western blotting?
7. Vad händer om Western Blot är negativ?
8. Tvättar du efter att ha blockerat Western blot?
9. Hur lång tid tar Western blot-resultat?
10. Hur kan jag förbättra min Western blot??
11. Varför finns det flera band i Western blot?
12. Hur bekräftar du överföring av proteinband från gel till membran i Western Blot-protokollet?

Vad är principen för Western blotting?

Western blotting (protein blotting eller immunoblotting) är en snabb och känslig analys för detektion och karakterisering av proteiner. Det bygger på principen för immunokromatografi där proteiner separeras i polyakrylamidgel enligt deras molekylvikt.

Hur fungerar Western blot-testet?

Under testet tas ett litet blodprov och det används för att upptäcka HIV-antikroppar, inte själva HIV-viruset. Western blot-testet separerar blodproteinerna och detekterar de specifika proteinerna (kallade HIV-antikroppar) som indikerar en HIV-infektion.

Varför smetas min Western blot??

Det kan inte finnas ett problem med gelén eftersom markören har intakta band, kanske det kan finnas ett problem med proteinet, det kan ha bryts ned eller kontrollera med något positivt prov. ... Använd mindre protein och / eller prova en immunutfällning för att berika ditt mål i lysatet. Späd antikroppskoncentrationen.

Vad visar Western blot-analys?

Western blot används ofta i forskning för att separera och identifiera proteiner. I denna teknik separeras en blandning av proteiner baserat på molekylvikt, och därmed per typ, genom gelelektrofores. ... Eftersom antikropparna bara binder till proteinet av intresse, bör endast ett band vara synligt.

Vilken funktion har Western blot??

En western blot är en laboratoriemetod som används för att detektera specifika proteinmolekyler bland en blandning av proteiner. Denna blandning kan inkludera alla proteiner associerade med en viss vävnad eller celltyp.

Vilka är tillämpningarna av Western blotting?

Vanliga Western Blot-applikationer

• Detektera fosforyleringstillstånd av proteiner. ...
• Upptäcka förändringar i proteinnivåer över behandlingsgrupper. ...
• Upptäcka förändringar i proteinnivåer över tidpunkter. ...
• Detektera trunkerade isoformer av proteiner. ...
• Detektera märkta proteiner.

Vad händer om Western Blot är negativt?

Ett negativt Western blot-test betyder att ELISA-testet var ett falskt positivt test. Western blot-testet kan också vara oklart, i vilket fall mer testning görs. Negativa tester utesluter inte HIV-infektion.

Tvättar du efter att ha blockerat Western blot?

Blockering är ett mycket viktigt steg i immundetekteringsfasen av Western-blotting eftersom det förhindrar icke-specifik bindning av antikropp till blottingmembranet. Efter blockering sköljs blottet i tvättbuffert, vanligtvis TBST, med försiktig omrörning och i tillräcklig volym för att hålla blotten nedsänkt. ...

Hur lång tid tar Western blot-resultat?

Lyme-sjukdomens blodprov, Western blot används för att upptäcka antikroppar som är specifika för B burgdorferi. Beredning: Ingen speciell förberedelse krävs. Testresultat: 7-10 dagar. Kan ta längre tid på grund av förseningar i väder, semester eller laboratorium.

Hur kan jag förbättra min Western blot??

Lösning

1. Minska den primära antikroppskoncentrationen.
2. Minska mängden totalt protein laddat på gel.
3. Justera förhållanden för membranblockering.
4. Öka antalet tvättar.
5. Kontrollera antikroppens specificitet.
6. Blott med enbart den sekundära antikroppen.
7. Om band utvecklas, välj en alternativ sekundär antikropp.

Varför finns det flera band i Western blot?

Flera ospecifika band på blot kan bero på antikroppar av dålig kvalitet eller med för hög koncentration, otillräcklig blockering eller ospecifik bindning på grund av närvaron av SDS.

Hur bekräftar du överföring av proteinband från gel till membran i Western Blot-protokollet?

Proteinöverföringsprotokoll

1. Förbered PVDF-membranet genom att fukta det i metanol i 30 sekunder och sedan blötlägga det kort i destillerat vatten följt av 1X överföringsbuffert. ...
2. Blötlägg filterpapper och svampar i överföringsbufferten i 10 minuter innan överföringsmackan monteras.