Western blot felsökning

Lös dina Western blot-problem med dessa felsökningstips, som täcker vanliga orsaker till ingen signal, hög bakgrund, flera band och mer.

1. Ingen signal
2. Hög bakgrund.
3. Flera band.
4. Ojämna vita "fläckar" på fläcken.
5. Svarta prickar på fläcken.
6. Vita band på en svart fläck.
7. Molekylviktsmarkörfält är svart.

1. Varför fungerar inte min Western blot??
2. Varför smetas min Western-fläck?
3. Vad som orsakar icke-specifik bindning i Western blot?
4. Tvättar du efter att ha blockerat Western blot?
5. Hur kan jag förbättra mitt Western blot-resultat?
6. Varför använder vi mjölk i Western blot?
7. Varför finns det flera band i Western blot?
8. Vilka är stegen i Western blotting?
9. Kan du överföra en Western blot??
10. Hur minskar du ospecifika band i Western blot?
11. Vad betyder banden på Western blot?
12. Hur förhindrar du proteinnedbrytning i Western blot?

Varför fungerar min Western blot inte??

Felsökning av en fläck (som vad som helst inom vetenskapen) måste vara nere metodiskt. ... Till exempel; proteinkoncentrationen du använder räcker inte, du använder fel provbuffert, blotting gick inte bra, antikroppen du använder fungerar inte eller du använder den i fel koncentration.

Varför smetas min Western-fläck?

Det kan inte finnas ett problem med gelén eftersom markören har intakta band, kanske det kan finnas ett problem med proteinet, det kan ha bryts ned eller kontrollera med något positivt prov. ... Använd mindre protein och / eller prova en immunutfällning för att berika ditt mål i lysatet. Späd antikroppskoncentrationen.

Vad orsakar icke-specifik bindning i Western blot?

En av de vanligaste orsakerna till icke-specifika band är ofullständig blockering. Blockerande buffertar används för att förhindra primära och sekundära antikroppar från att binda till membranet eller något annat än proteinet av intresse.

Tvättar du efter att ha blockerat Western blot?

Blockering är ett mycket viktigt steg i immundetekteringsfasen av Western-blotting eftersom det förhindrar icke-specifik bindning av antikropp till blottingmembranet. Efter blockering sköljs blottet i tvättbuffert, vanligtvis TBST, med försiktig omrörning och i tillräcklig volym för att hålla blotten nedsänkt. ...

Hur kan jag förbättra mitt Western blot-resultat?

Lösning

1. Minska den primära antikroppskoncentrationen.
2. Minska mängden totalt protein laddat på gel.
3. Justera förhållanden för membranblockering.
4. Öka antalet tvättar.
5. Kontrollera antikroppens specificitet.
6. Blott med enbart den sekundära antikroppen.
7. Om band utvecklas, välj en alternativ sekundär antikropp.

Varför använder vi mjölk i Western blot?

Blockering är ett mycket viktigt steg i western blotting, eftersom det förhindrar antikroppar från att bindas till membranet ospecifikt. Blockering görs ofta med 5% BSA eller fettfri torkad mjölk utspädd i TBST för att minska bakgrunden. ... Antikroppen kan spädas i en tvättbuffert, såsom PBS eller TBST.

Varför finns det flera band i Western blot?

Flera ospecifika band på blot kan bero på antikroppar av dålig kvalitet eller med för hög koncentration, otillräcklig blockering eller ospecifik bindning på grund av närvaron av SDS.

Vilka är stegen i Western blotting?

Fem steg är involverade i western blotting-procedur och detektionsanalys, nämligen transfer, blockering, primär antikroppsinkubation, sekundär antikroppsinkubation och proteindetektion och western blotting-analys..

Kan du överföra en Western blot??

Med ökande tid finns emellertid en risk för över-överföring (strippning, genomblåsning) av proteinerna genom membranet, speciellt för lägre molekylvikt (<30 kDa) proteiner vid användning av membran med en större porstorlek (0,45 um). Arbetsflöde av våt / tankelektroöverföring av protein för western blotting.

Hur minskar du icke-specifika band i Western blot?

Om du har problem med icke-specifik bindning, överväg:

1. Öka den blockerande exponeringstiden och / eller temperaturen som du blockerar.
2. Använd en högre proteinkoncentration i bufferten.
3. Lägga till 0,1% Tween till bufferten.
4. Jämföra helt med en annan blockeringsbuffert.

Vad betyder banden på Western blot?

Först mäter Western Blot-testet de antikroppar som din kropp gör för att attackera Lyme-infektionen. ... I denna släkting var bandet ett "fingeravtryck" -band. ” Det betyder att Lyme är den enda organismen som gör att människokroppen producerar denna antikropp.

Hur förhindrar du proteinnedbrytning i Western blot?

Hur du bevarar dina prover i Western Blotting

1. Arbeta snabbt. Att arbeta snabbt kan minimera potentiell skada på dina prover genom att helt enkelt tillåta mindre tid för dem att försämras. ...
2. Håll allt svalt. Värme är fienden till proteiner i lösning, eftersom proteaser är aktiva vid varmare temperaturer. ...
3. Använd proteashämmare.